Endonucleases que reconhecem seqüências específicas de base dentro de uma hélice de DNA, criando uma dupla cadeia quebram do DNA.

Nota: tipo I restrição enzimas ligam a estes locais de reconhecimento, mas posteriormente cortar o DNA em locais diferentes. Enzimas de restrição de tipo II tanto ligar e cortar em seus sites de reconhecimento ou de destino.