En klasse af endonucleases, der kløver DNA efter genkende en bestemt sekvens, fx Bam H1 (5´GGATCC3´), Eco RI (5´GAATTC3´) og Hin dIII (5´AAGCTT3´). Der findes tre typer begrænsning endonuklease enzymer:

Type I: nedskæringer ikke specifikt en afstand større end 1000 bp fra dens anerkendelse sekvens og indeholder både begrænsning og methylering aktiviteter.

Type II: Nedskæringer på eller nær en kort, og ofte palindromiske (q.v.), anerkendelse sekvens. a separat enzymet methylates samme anerkendelse sekvensen. De kan foretage nedskæringer i de to DNA indsatsområder præcis modsat hinanden og generere stumpt slutter, eller de kan gøre forskudt udskæringer til at generere klæbende ender. Type II-restriktionsenzymer er dem almindeligt udnyttes i rekombinant dna-teknologi.

Type III: nedskæringer 24-26 bp nedstrøms fra en kort, asymmetrisk anerkendelse sekvens. Kræver ATP og indeholder både begrænsning og methylering aktiviteter.